Una vez en la fase estacionaria de crecimiento, se actúa en dos niveles: el tipo de biorreactor y la composición / condición del medio de cultivo. El primer parámetro nos permite calibrar el cultivo hacia una adecuada producción de principios activos. Según el tipo de biorreactor y las condiciones de crecimiento que éste impone, se distinguen los siguientes:
- Biorreactores de circuito cerrado: las células del inóculo se cultivan hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento, el medio siempre permanece igual y el sistema permanece cerrado; de esta manera las células comienzan por sí mismas a producir metabolitos secundarios, ya que sienten cómo un suficiente elemento de estrés es la falta de uno de sus nutrientes.Las células se mantienen en un sistema cerrado para producir metabolitos secundarios durante un período de tiempo específico, que va desde unos pocos días hasta una semana completa - 15 días; después de este tiempo, el sistema se abre y los metabolitos secundarios se extraen del medio y de las células (algunos metabolitos quedan atrapados en la vacuola mientras que otros se liberan al medio ambiente).
- Biorreactores de ciclo semicontinuo: ciclo adaptado a aquellos tipos de cultivos que necesitan elementos adicionales de estrés, además de la falta de factores nutricionales y de crecimiento del suelo. Se llama semicontinuo porque ya en medio del crecimiento exponencial las células comienzan a producir metabolitos secundarios; esto probablemente se deba a un cambio en el medio de cultivo, por ejemplo debido a la extrusión masiva de un catabolito de desecho secundario, tóxico para las células y por lo tanto un elemento de estrés. En este punto, el 50% de la masa celular se extrae del biorreactor, con el 50% de medio de cultivo; A continuación, se extraen los distintos ingredientes activos de esta muestra.
Se agrega una alícuota equivalente de medio nuevo al biorreactor en el que está contenido el porcentaje restante de células y medio de cultivo, para permitir que las células reanuden una fase de crecimiento exponencial desde el tiempo cero. En este caso, el sistema se abre cuando las células están todavía en la fase exponencial El biorreactor se define como "semicontinuo" porque se extraen cantidades pequeñas pero suficientes de ingredientes activos a intervalos regulares.
El sistema de crecimiento cerrado o semicontinuo se elige en función de la capacidad productiva del tipo celular, hay células que producen más metabolitos con un determinado sistema de crecimiento que con otro.
- Biorreactores de ciclo continuo: son los más utilizados, los más modernos y de ingeniería. Permiten que el cultivo alcance la fase estacionaria de crecimiento; en este punto, se toman alícuotas muy pequeñas de células y medio en continuo a intervalos de tiempo regulares y estrechos; la pequeña extracción permite que el callo regenere el mismo número de células que se han eliminado, mientras que el medio recolectado se reemplaza por uno nuevo. De esta manera las células se mantienen en equilibrio en el hilo de la producción de principios activos; un hilo que representa la optimización en términos de calidad y cantidad de la producción de principios activos. Este muestreo constante y continuo, así como la incorporación de nuevo suelo, es monitoreado de forma automatizada por quimiostatos y turboestatos El quimiostato es el equipo encargado de monitorear las condiciones de cultivo, como el pH y los elementos nutricionales que constituyen el suelo; cuando estos no son suficientes, el equipo interviene introduciendo los medios correctores. Los turboestatos, por su parte, miden la densidad óptica del cultivo, que es directamente proporcional a la cantidad de células; cuando éste alcanza un valor umbral máximo, un Se toma una pequeña cantidad, posteriormente se somete a extracción de los ingredientes activos.
- Biorreactores de células inmovilizadas: modalidad similar al tipo de circuito cerrado, sin embargo difiere cuando, una vez comprobada la capacidad del cultivo celular para producir metabolitos secundarios, se introducen en el biorreactor, que permanece cerrado, compuestos gelatinizantes o soportes sólidos. Estos soportes permiten que el cultivo en suspensión se convierta en cultivo sólido siempre dentro de un biorreactor, donde las células se encuentran en forma de microagregados igualmente en contacto con el medio de cultivo, por lo tanto igualmente sensibles a los estímulos del medio. Para ciertos cultivos celulares pertenecientes a determinada planta especie el soporte sólido representa de hecho un estímulo mecánico capaz de inducir una diferenciación morfológica y funcional sensible; en otras palabras, las células comienzan, aunque lentamente, a diferenciarse en tejidos organizados; una diferenciación morfo / fisiológica macro o microscópica corresponde la mayor parte del tiempo a una diferenciación metabólica En conclusión, la inmovilización de los cultivos puede favorecer la producción de compuestos secundarios.
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